第十八章　血清载脂蛋白的免疫测定•第一节　血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

中医古籍•第十八章　血清载脂蛋白的免疫测定•第一节　血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

一、载脂蛋白测定方法

1．单向免疫扩散法（radialimmunodiffusion,RID）

该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原（血清）量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

2．电免疫测定法（electroimmunoassay,EIA）

该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。

3．免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA）

简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法（INA）；需用特殊的激光浊度仪；另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法（ITA），其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。

4．酶联免疫法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）

该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）

该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用125I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘标记（氯胺T法），以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。

还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。

刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表：

表18-1　ApoAⅠ免疫测定法的比较

P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。

（源自：刘秉文，1995.）

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-4 ApoB100免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

二、人血浆（清）载脂蛋白参考值比较

刘秉文于1995年对国人血浆（清）各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

*：作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数，如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外，并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录，供参考。

表18-16 血脂与脂蛋白水平（mmol/L）

（源自:王抒，1996）

表18-17 几项常用比值*

男女组间无显著意义

（源自：王抒，1996）

表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

国内的已有报道表明，人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的，目前认为主要原因有：①检测方法与仪器不同；②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一；③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清；④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立，尚需付出艰辛的劳动。